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基于傅里叶变换红外光谱的黄瓜褐斑病早期检测

引 言 病害的发生经常导致农作物大面积减产和品质下降…,快速、准确地对病害进行鉴定是有效防治的重要环节[2]。常用的作物病害诊断方法主要有显微镜技术[3]、血清学技术[41和分子生物学技术[5’6]等,这些技术虽然能够进行精确的检测,但是需要耗费大量的时间和成本,并且需要专业人员进行操作,因而不能应用到实时的农田病害检测中。植物发病以后,其新陈代谢会发生一定的改变,对植物内部细胞及色素含量、水分和细胞间隙等产生影响[7],而且其内部生理结构及色素含量等化学成分的变化往往先于病害症状的出现,因而植株染病部位的光谱特性也先于外部病害症状发生变化[8.9]。傅里叶变换红外光谱(fouriertransforminfraredspectroscopy,FTIR)技术作为一种快速简便、灵敏度高、重复性好的分析技术,通过采集红外谱区包含的物质内部信息,来进行物质特性的定性和定量分析,被广泛地用于各个领域Do-lz]。本文对以黄瓜褐斑病[(Corynesporacassiicola Berk.&Curt.)Wei]为研究对象,采用傅里叶变换红外光谱技术,获取发病叶片和健康叶片的红外光谱信息,目的是寻找能够检测黄瓜褐斑病发生的敏感谱带,为病害的早期检测提供一种新的方法。 1材料与方法 1.1黄瓜褐斑病接种黄瓜褐斑病由多主棒孢霉(Corynesporacassiicola)引起。这里采用人工接种的方法获取黄瓜褐斑病叶片样本。致病菌来源于中国农业科学院蔬菜花卉研究所综合防治课题组,选择长出4~5片真叶的黄瓜植株进行接种。将菌株从4℃冰箱取出培养一周,配制成浓度为105个孢子·mL_1的悬浮液,采用点滴法接种,每个叶片分别在叶脉两侧滴一滴10肚L的孢子悬浮液,保湿培养24 h后正常管理。同时,在相同的环境条件下,对长势一致的黄瓜植株喷施清水作为对照。 1.2样本制备不同发病时期样本的制备:接种后,每天摘取感染褐斑病的黄瓜叶片和对照健康黄瓜叶片,清洗干净后晾干,直至病害严重Ⅱf‘片枯死。取样时避开叶脉取接种部位直径lcm的圆斑,样本冷冻干燥后,放人玛瑙研钵磨成粉末。病斑不同部位样本的制备:采集病害发生后期、病斑直径大于2cm的病叶,清洗干净后晾干。分别从每个叶片上取病斑中心部位、病健交界部位和无病症健康部位的样本,冷冻干燥后,放入玛瑙研钵磨成粉末。 1.3咖t光谱测量红外光谱测定采用Perkin-Elmer公司的Spectrum100傅里叶变换红外光谱仪与衰减全反射ATR附件,中红外检测器。ATR数据从配有ZnSe晶体的变角衰减全反射附件上取得,光线入射角为45℃。将研细的样品粉末平铺在ZnSe晶体的凹槽中,压紧,即可测其红外光谱。测试条件:光谱分辨率4cm,测量范围4000 800 cm。扫描信号累加32次,自动平滑处理。扫描时实时扣除Hz0和C02的干扰。设不放入任何样本的空扫描作为背景,每测量5个样本,进行一次背景扫描。 1.4数据分析将测得的原始光谱数据应用Spectrum100 FTIR光谱仪自带的Spectrum软件,进行归一化处理,选择检测黄瓜褐斑病发生的敏感谱带。然后,计算敏感谱带的峰面积值,对褐斑病叶片和健康叶片进行系统聚类分析。系统树的构建采用离差平方和法(Ward’s),数据分析应用SAS9.0软件。 2结果与讨论 2.1黄瓜褐斑病叶片与健康叶片的n1R光谱分析图l列出了对照健康黄瓜叶片样本和多主棒孢菌感染的黄瓜褐斑病叶片样本的FTIR光谱,图中光谱为所测样本的平均值。可以看出,二者红外谱图在4000~400cm_1整体较为相似,有一些典型的共有峰。在3286 cm_1附近有一个极强且宽的吸收峰,主要是OH伸缩振动吸收区;2920和2 850cm_1是CHz的伸缩振动区;1735cm_1是酯类C=O振动吸收区;1635 cm_1是酰胺I带蛋白质C--O伸缩振动区;1545 cml是酰胺Ⅱ中带N—H和C-一N的变形振动区;1400cml附近是C_o—H的弯曲振动区;l240 cm_1附近是C-一。键的伸缩振动区;1142,l 090和1019 cm_1主要是多糖的吸收区。通过黄瓜叶片的傅里叶变换红外光谱,可以看出黄瓜叶片的主要成分是蛋白质、糖类和脂类化合物。4000 3 200 2400 1 800 1 400 l 000Wayenumber/cm一’lOg.1FrIRspectraofcucmnberleaves infectedwithCcassiicolaand controluninfected leaves健康样本与褐斑病样本的FTIR谱图在某些区域内存在较大的差别,这些特征性区域如下:(1)1735cm~:黄瓜健康叶片在1735cml处有明显的吸收峰,而多主棒孢菌感染的黄瓜褐斑病叶片样本在此处的谱峰较缓,此处吸收峰主要是由酯C=O的伸缩振动引起[13。,叶绿素分子的卟啉酯在此处有特征性吸收峰[1“,说明褐斑病的发生使叶片叶绿素含量降低,该结果与采用生理生化方法测得的结果一致。(2)l 545cm:黄瓜健康叶片在1545cml处呈现强烈的吸收峰,而多主棒孢菌感染的黄瓜褐斑病叶片样本此处的谱峰较舒缓,该区域吸收峰主要是由酰胺Ⅱ中N—H和C:N的变形振动及其他结构蛋白基团的振动引起。这一差异说明与褐斑病叶片相比,健康的黄瓜叶片样本含有更为丰富的蛋白成分。(3)1 240 cm:此处吸收峰主要由木质素中苯羟基中c—O键的伸缩振动引起。受褐斑病菌侵染后,黄瓜叶片FTIR谱图在此处的吸收强度较健康黄瓜叶片的吸收峰强度有所降低。 2.2黄瓜褐斑病叶片不同部位FrIR光谱分析选择黄瓜褐斑病发病后期的叶片,分别取病斑中心处、病健交界处和无病症健康部位的样本,图2为褐斑病叶片不同部位样本的FTIR光谱。结合图1和图2可以看出,接种健康部位的FTIR谱图与不接种健康叶片的FTIR谱图相似,病健交界处样本的FTIR谱图与病害发生中期样本的谱图相似,而病斑中心样本的FTIR谱图与病害发生后期样本的FTIR谱图相似。接种健康部位样本的FTIR谱图在1 735,1545和1240 cm_1处吸收峰很明显,病健交界处次之,而病斑中心样本吸收峰最弱。 2.3黄瓜褐斑病的早期诊断选择1735,1545和1240 cm_1作为褐斑病菌是否侵染的敏感谱带。这里采用计算吸收峰峰面积的方法[15]来进行叶片是否染病的检测。表1列出了随着接种时问的延长,感染褐斑病菌的黄瓜叶片和对照不接种叶片的FI'IR光谱在1735,1 545和1240 cm_1处的吸收峰面积值。从表中可以看出,接种后时间越长,黄瓜褐斑病叶片在三处峰面积值越小,说明随着病菌的侵染,染病叶片的叶绿素含量和蛋白质成分逐渐降低;而对照未接种的健康黄瓜叶片随着时问变化,FTIR光谱在三处的峰面积值并无显著差异。从症状观察,接种多主棒孢菌后经过5天的潜育期,黄瓜叶片才表现出症状。但利用红外光谱数据分析(表1),接种后第2天就可以根据其FTm谱图在1735,1545和1240cm。处峰面积值的变化来确定褐斑病的发生,为病害的早期式奄u口g{目∞q胃I|∞∞踮加∞如∞如更b苎日篁E∞矗雷■万方数据1508 光谱学与光谱分析 第3l卷诊断提供依据。对三个敏感谱带的峰面积值(Area)进行量化,发现健康黄瓜叶片在1735cm_1处峰面积值≥2.00(褐斑病叶片此处峰面积值≤o.64),l545 cm_1处峰面积值≥5.50(褐斑病叶片此处峰面积值≤2.39),l240 em_1处峰面积值≥3.32(褐斑病叶片此处峰面积值≤3.oo)。利用这些特征,可以把正常黄瓜叶片和褐斑病黄瓜叶片区分开来。 2.4黄瓜褐斑病和健康叶片FrlR光谱的聚类分析为了验证利用1735,1 545和1240 eml峰面积值进行褐斑病诊断的有效性,笔者利用三个峰位的峰面积值对实验测试的接种多主棒孢菌的黄瓜叶片和未接种的健康叶片的FTIR光谱进行了聚类分析,刚3为聚类分析结果图。从图中可以看出,通过系统聚类分析,可将褐斑病和健康叶片直1.0 0.8 06 040.2 0.0Heterogeneit-]rig.3ClusteranalysisofFrIRspectrarecordedfromdiseasedandhealthycucumbersamples观清楚的区分开来。感染褐斑病样本和健康样本类内差异性值都小于0.I(分别为0.02和0.05),而两类样本间的差异性值为0.87,远远大于样本内部差异。说明两个类别问差异极其显著,利用红外光谱技术可以准确地对黄瓜褐斑病进行检测。 3结论 用傅里叶变换红外光谱技术研究当病症还未在叶片表面出现时对黄瓜褐斑病的早期诊断方法,以期更好地控制病害的传播。分析黄瓜褐斑病与健康叶片的FTIR光谱,发现染病叶片与健康叶片的FTIR谱图在1735,1 545和1 240cm_1处峰面积值差异较大。健康叶片在这三处表现明显的吸收峰,而染病叶片在这三处的吸收峰随病害发展谱峰逐渐平缓,说明随着病害的发展,染病叶片中叶绿素和蛋白质含量逐渐降低。选用1735,1 545和1240cm_1作为黄瓜褐斑病检测的敏感波段,利用其峰面积值的变化,在接种后第2天就可以确定褐斑病的发生,但通过叶面观察5天后才可看见症状。原因可能是由于植物在染病后,其内部生理结构先于病害症状发生变化,因而染病部位的光谱特性也先于外部症状发生变化。说明傅里叶变换红外光谱能够实现在病症还未在叶表出现时的早期检测,为今后光谱技术应用于植株病害的早期检测提供了新的途径。

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