NO.01
认证: 论文检测

掌柜:论文查重第一家

点击这里给我发消息

支付宝个人认证

2011-03-24

消费者保障协议

该店铺已签署消费者保障协议
已缴纳1000元保证金

店铺动态评分

描述相符5.0

服务态度5.0

物流服务5.0

与同行业相比

高于1.23%

持平0.45%

高于4.31%

开店时长5年老店

核酸适配体在生化分离及检测领域中的研究进展

引—三一口核酸存在于所有生物体中,它携带着遗传信息,在生命活动中,通过控制蛋白质的合成,引导着生物的发育与生命机能的运作,由于核酸在生物体中的重要作用,一直以来受到人们广泛的关注。在过去的二十多年里,人们发现特定序列的寡核苷酸链能够特异性地结合靶分子,这类寡核苷酸被称为核酸适配体。这时人们的注意力从关心核酸链所承载的遗传信息转移到它特异性的分子识别能力上。尽管核酸适配体被提出仅二十多年的时间,但由于其巨大的应用潜力,引起了人们的研究兴趣并得到了极大的发展。目前适配体的应用主要包括在检测系统中作为分子识别元件,在物质分离富集过程中作为能够与靶目标发生特异性结合的配基以及在医学上用于临床诊断和治疗。本文主要概述了适配体在生化分离及检测领域中的应用。 1 核酸适配体和SELEX技术核酸适配体,是指-/J,段能与相应配体专一性紧密结合的寡核苷酸序列,一般由几十个核苷酸组成,可以是DNA也可以是RNA,最早是由Tuerk和Gold发现的[1]。1990年,Tuerk等提出了一种新的体外筛选和扩增核酸的方法,命名为SELEX(指数级富集配体系统进化),利用该方法他们成功地筛选出能够特异性结合T4DNA聚合酶的RNA寡核苷酸。但当时他们并没有对这种RNA寡核苷酸进行命名,只是称其为配基。核酸适配体这一概念是由Ellington和Szostak提出的[2]。同年,Ellington等同样利用SELEX技术成功筛选出了能够与汽巴克隆蓝、活性蓝4发生特异性结合的RNA,命名为aptamer(适配体),它来源于拉丁语aptus,意思为“合适”。两年后,他们再次利用SELEX技术筛选到了一种单链DNA适配体口]。从以上开创性的工作来看,核酸适配体的发现在于SELEX技术的提出,因此下面首先对SELEX技术进行简单的介绍。SELEX技术的基本流程如下[4]:首先通过化学合成的方法获得一个约含有1015个不同寡核苷酸的随机序列库,把靶分子加入到该库中,待充分结合后,将与靶分子结合的寡核苷酸序列分离出来。通过聚合酶链反应(PCR),对从靶分子一寡核苷酸复合体上洗脱下来的核酸进行扩增,得到新的组合库后再进行下一轮的筛选。一般通过6---20轮的反复分离和扩增循环,就可以产生能够特异性地结合靶分子的核酸适配体。 总结来说,SELEX技术包括五个基本的步骤,即:结合、分离、洗脱、扩增和调节,通过迭代循环得到目标适配体。SELEx技术的提出奠定了核酸适配体发展的基础,但SELEX是一个相对较慢和复杂的过程,要想获得对特定靶目标具有高度亲和性的适配体是一个较难而且十分耗时的过程。因此人们一直致力于对最初SELEX技术的改进,以期加快适配体的筛选过程。目前,许多针对SELEX技术改良的研究已取得了可喜的成果[5。7],易于操作和自动化的SELEX程序的开发正在进行中,这将进一步推动核酸适配体的发展和应用。由SELEX技术筛选出的核酸适配体对靶目标表现出特异性的识别力和高度的亲和力,适配体一靶目标复合物的解离常数通常在微摩尔到纳摩尔范围内,有的甚至达到皮摩尔[8],因此核酸适配体被人们比喻为“化学抗体”。但实际上核酸适配体在很多性能方面超过了抗体凹。0|。(1)用于筛选适配体的随机寡核苷酸序列库是通过化学合成的方法得到的,不依赖于生物体,并且适配体的筛选过程无须在生理条件下进行,因此筛选出没有免疫原性或低免疫原性甚至具有毒性的靶分子的核酸适配体都是有可能的。(2)核酸适配体的目标范围广,靶目标可以是蛋白质大分子,也可以是氨基酸、金属离子、糖类等小分子。(3)化学合成的适配体纯度高,批间差异小,而抗体的合成是在细胞株或生物体内完成的,批间差异大。(4)核酸适配体具有较高的热稳定性,变性的适配体也很容易再生。而抗体的热稳定性较差,较容易发生变性。(5)核酸适配体的末端易于连接一些活性基团,容易被固定在基质上,或可以在适配体末端修饰一些指示基团,便于进行检测。而抗体的修饰要困难得多。经核磁共振及X射线晶体衍射等手段研究发现核酸适配体能够特异性地结合靶目标的原理在于[1卜13]:当靶目标存在时,核酸适配体构象发生变化,折叠成特定的三维结构,比如茎、内环、凸环、发夹、四角环、假结体、三重体和G一四链体结构,通过形状匹配、芳香化合物间的堆积作用、适配体的碱基堆积作用、带电基团的静电作用或氢键作用等实现与靶目标的特异性结合。 2核酸适配体在生化分离领域中的研究进展发展新型的分子识别技术是实现生物产品高选择性分离所面临的一个关键问题。分子识别是指在复杂的混合物体系中,一个分子或分子片段特异性地识别另一个分子或分子片段,并相互结合形成一个复合物或超分子的现象。近几十年来,由于抗体与抗原之间具有专一的识别性质而被广泛用于亲和万方数据第1期 李晓佩等:核酸适配体在生化分离及检测领域中的研究进展 ·235‘分离及疾病检测的研究中。然而,抗体的制备及应用离不开生物体,而且抗体对温度等环境变化非常敏感,在脱离生理环境下很容易发生变性m]。这些缺点使得将抗体一抗原亲和作用应用于酶等生物产品规模化分离受到了限制。 近年来,分子印迹技术由于具有抗恶劣环境的能力,表现出稳定性强和使用寿命长等优点,因此对其合成及应用的研究十分活跃,如手性物质分离、生物传感器、氨基酸及多肽等生物大分子、金属离子、药物分子、天然产物的分离与纯化等方面。但是,以氢键、螯合等相互作用及空间识别为基础的印记技术选择性还不够专一,对一些与印记分子结构相似且尺寸相近的分子仍会与模板发生非特异性吸附[1518]。这一问题影响了分子印迹技术在生物产品分离上的选择性。而核酸适配体结合了抗体亲和技术及分子印迹技术两者的优点,不仅选择性专一,而且具有性质稳定、易合成、易标记、分子量较小、目标分子广泛等优势,因此其在生化分离领域显示出广阔的应用前景。但值得注意的是实现生化分离的关键不仅在于特异性的分子识别能力,同时还要考虑特异性识别后如何实现复合物的解离。由于核酸适配体对小分子的解离常数通常在微摩尔范围内,适配体一小分子复合物的解离比较容易,通过调节流动相的组成[17]或稍升高温度就可以实现靶目标从复合物上的释放。比如,Lin等[1}191利用固载的核酸适配体分离AMP,通过提高温度实现AMP的解析。 实现结果表明,当温度达到32.5℃时,解析率已达到93%。并且升温解析并不影响核酸适配体的循环使用。此外,一些适配体需要折叠成特定的二级结构才能特异性地结合靶目标,而这些二级结构的形成往往受镁离子和钙离子的调控。基于这一原理,在洗脱液中加入EDTA去螯合镁离子和钙离子,破坏适配体的二级结构,从而实现靶目标从复合物上的释放[zo21o。此外,在溶液中加入竞争分子也可以实现靶分子的释放。Qing等[22]设计了一种核酸适配体亲和色谱柱用于腺苷的富集。该研究小组发现在洗脱液中加入镍离子有利于腺苷的洗脱,这是因为镍离子与适配体为竞争关系,也可以与腺苷结合。并且最终实验结果表明加入竞争分子的洗脱方法效率高于加入EDTA的洗脱方法。然而当待分离的靶目标是蛋白质时,复合物的解离就比较困难,因为适配体对蛋白质的结合能力比小分子大约强三个数量级,解离常数在纳摩尔范围内,有的甚至在皮摩尔范围内。 这时复合物的解离就需要借助较高的温度、高浓度的盐水、较高或较低的pH值等激烈的条件,但在这样的条件下,蛋白质的活性会降低甚至会发生变性,由于以上的原因,核酸适配体用于蛋白质分离纯化的报道并不多。一些成功的报道也仅基于待分离的蛋白质稳定性较高,采用激烈条件洗脱后仍能保持活性的特性。比如,Huseyin等口胡把末端修饰了巯基的Tap一聚合酶适配体固载到表面带有环氧基团的高聚物磁性微球上,固载了适配体的微球用于Tap一聚合酶的分离纯化,最后用1mol·L_1的NaCl溶液实现了Tap一聚合酶的解吸,并且验证了解吸后的Tap一聚合酶仍保持活性。Sahar等[243把核酸适配体用于MutS蛋白质的分离,纯化。最后用6mol·L_1的尿素洗脱,实验证明洗脱下来的蛋白质仍保持活性。Adam等口51用8mol·L-1尿素和加热到50℃的方法把凝血酶从复合物中洗脱下来,但文章中没有对洗脱下来的凝血酶是否还保持活性进行论述。Oznur等[2钼通过固载后的核酸适配体6H7和6H5实现了His-tagged蛋白质的分离纯化,用1mol·L.1的咪唑洗脱,同样作者也没有对洗脱下来的蛋白质的活性进行考察。 不过文中对固载后的核酸适配体的循环使用情况进行了研究,发现固载后的核酸适配体在循环使用6次后,蛋白质的负载量分别下降到68%(6H7)和56%(6H5),分析原因可能为蛋白质洗脱的不彻底和在使用过程中固定相的流失。此外,人们还对温和的洗脱条件进行了探究。Michael等[z73使用核酸酶酶解核酸适配体,得到目标蛋白。尽管采用酶解的方法不会影响到目标蛋白的活性,但最终只能得到核酸酶和目标蛋白质的混合物,要想得到纯目标蛋白质还需要进一步的纯化。此外核酸适配体被酶解,不能循环使用。Cho等12副通过一个可被光照解离的连接臂,将可识别丙型肝炎病毒RNA聚合酶或复制酶的RNA适配体连接在微球上。待目标酶被选择性吸附在RNA适配体固定相上后,用360nm的紫外线照射导致连接臂断裂,适配体和目标酶的结合物从固定相上解离下来。 引入可被光照解离的连接臂可避免采用剧烈的洗脱条件,但是光照后连接臂断裂使得紧密结合的酶和适配体同时脱离固定相,而目标酶并没有与适配体发生解离。这对以检测为目标的工作没万方数据·236· 化工学报 第64卷有影响,但不能满足酶分离纯化的要求(图1)。Jahir等[29]把凝血酶适配体和ATP适配体连接在一起,命名为MBA。通过ATP适配体与基底上的部分互补链杂交而固载。把结合了凝血酶的装置置于ATP的溶液中,足量的ATP可以导致结合了凝血酶的MBA从基底表面上脱离下来(图2)。但该方法也只是把凝血酶与适配体形成的复合物同时从基底上脱离了下来,文中并未对怎样使凝血酶从复合物中脱离下来做后续分析,因此从这种意义上来讲,并没有真正实现凝血酶的分离纯化。卿一。齄3 RNA》一R一垒“”k‘垒瓜图1 光照降解连接臂释放靶蛋白F28]Fig.1 Capturedproteinis elutedbyUVirradiationF28]图2引入ATP竞争适配体活性位点释放靶蛋白m3Fig.2Release ofcaptured protein byusing competitiveATP[29]3 核酸适配体在检测领域的研究进展核酸适配体能够特异性地识别靶目标,这一性质使得适配体在检澳4领域大有用武之地。 目前核酸适配体已被应用在了很多种检测手段中,比如ICP—MS[”]、SPR[3“、色谱‘”]、毛细管电泳‘3胡和生物传感器[3钉等。其中关于核酸适配体在亲和色谱和传感器中应用的报道最为广泛。赵强等【353已对核酸适配体亲和色谱的发展、应用以及面临的问题和前景做了详细的介绍。本文主要概述了核酸适配体在电化学、光学及声学生物传感器中的应用。生物传感器是一种以生物物质(如酶、抗体、抗原、微生物等)作为识别元素的分析元件,具有高选择性、高灵敏度和操作简单等优点,在制药、生物医学、化工、临床检验、环境监测、食品等领域有广泛的应用前景。在生物传感器中,识别元素是最为关键的构件。相对于其他识别元素,适配体的优势在于:(1)具有专一性识别靶目标的特性;(2)具有高的化学稳定性,可在pH 2~12之间保持稳定,即使经过100℃变性,在室温下也可以恢复;(3)适配体可以通过折叠与去折叠捕获和释放靶目标,使得适配体修饰的表面可以重复使用;(4)适配体种类的多元化进一步扩大了传感器目标分子的范围;(5)适配体易于修饰,可以灵活方便地构建各种传感检测方法。因此核酸适配体的发现提高了生物传感器在实际应用中的潜力。目前核酸适配体已被应用在各类传感器中,比如电化学传感器、光学传感器以及声学传感器,其中针对核酸适配体在电化学传感器中的应用研究最多。下面就适配体在这三种传感器中的应用做简单的介绍。 3.1电化学传感器电化学传感器主要依靠氧化还原探针得失电子时产生的电信号来实现目标物的检测。目前有很多关于核酸适配体电化学传感器的报道,其中许多传感器的设计理念是通过使用凝血酶适配体检测溶液中凝血酶的含量来验证的。这是因为凝血酶适配体的分子结构以及它们与凝血酶发生特异性结合的机制已经很明确,相关文献表明凝血酶有两条对应的核酸适配体,一个是15碱基适配体,它对凝血酶的血纤维蛋白原结合位点具有识别性;另一个是29碱基适配体,它对凝血酶的发卡结构结合位点具有识别性[30I。这两条凝血酶适配体与靶目标发生特异性结合的机理相同,即当体系中存在凝血酶时,适配体的构象发生改变,形成e四链体与凝血酶发生特异性结合口3|。Xiao等[361把一端修饰了亚甲基蓝的凝血酶核酸适配体固载在电极上,当溶液中不存在凝血酶时,凝血酶核酸适配体链处于伸展状态,由于链的柔韧性,亚甲基蓝能接触到电极表面发生氧化还原反应,产生电信号,但是凝血酶一适配体复合物形成后,这种电子传递就会受到阻碍,电信号就会减弱,而电信号下降量与体系中凝血酶的含量存在对应关系。 这一方法的检测限大约为2×10_8mol·L~。用6 tool·L_1的盐酸胍处理可实现传感器的再生。Radi等[37]也设计了一种凝血酶电化学适配万方数据第1期 李晓佩等:核酸适配体在生化分离及检测领域中的研究进展 ·237·体传感器,但与Xiao等的思路正好相反,他们是通过电信号的增强来实现对凝血酶的检测。具体实验方案如下:经修饰后的凝血酶适配体一端连接二茂铁,另一端固载在金电极上。当体系中不存在凝血酶时,处于伸展状态的适配体链阻碍二茂铁与电极表面接触,而适配体结合了凝血酶形成G四链体结构后,二茂铁靠近电极,从而产生电信号。该传感器的检测限约为5×10-9mol·L~,通过使用1mol·L-1的盐酸实现传感器的再生(图3)。Polsky等[38]基于凝血酶有两个活性位点,能够同时结合两条不同DNA适配体这一性质,设计了一种三明治结构凝血酶电化学适配体传感器。首先将凝血酶第一适配体固载在电极上,与溶液中的凝血酶形成复合物。接着末端修饰了铂纳米粒子的凝血酶第二适配体与凝血酶结合后也吸附在了电极上。铂纳米粒子可以催化H:O:氧化,产生电信号。该方法的检测限为1×10-9mol·L~。Sonia等[39]设计的三明治结构凝血酶电化学适配体传感器结合了适配体能够特异性识别靶目标、磁性微球分离以及电信号检测的三重优势,在实际样品的检测中更加实用。他们首先把凝血酶第一适配体连接在磁性微球上,在与样品充分接触后进行磁分离。用缓冲液洗涤磁微球后,重新把磁微球分散到加入了凝血酶第二适配体的缓冲液中。 由于凝血酶第二适配体末端修饰了生物素,借助于链菌亲和素和生物素之间强的亲和力,修饰了链菌亲和素的磷酸酯酶也连接到了微球上。微球再进一步吸附在具有磁性的电极上,磷酸酯酶氧化溶液中的磷酸萘产生电信号,实现对凝血酶的检测。尽管该传感器在使用过程中的操作步骤比较多,但磁微球的使用可以确保目标物的检测不受复杂体系的影响,从这方面来讲,该传感器的实用性更强(图4)。Eva等[4叩设计的电化学适配体传感器同样结合了磁性微球、适配体以及电信号检测的三重优势,成功实现了对小分子抗生素一托普霉素的检测。但他们是把托普霉素固定在了磁微球上,通过检测体系中游离的托普霉素与固定化的托普霉素竞争托普霉素适配体,实现对托普霉素浓度的测定。相对于使用一个适配体的电化学传感器而言,三明治结构的凝血酶电化学适配体传感器的检测限更低,对于低含量凝血酶的检测更有优势,尤其是使用两条适配体可以把磁性微球引入到检测体系中,解除了复杂体系对检测目标物的干扰,增强了图3结合凝血酶前后凝血酶适配体的构象变化m3Fig.3Schematicrepresentationofaptamerconformationon electrode surfacebefore(coil-like)andafter(quadruplex)aptamer-thrombinassociationZ37]■9/workingelectrodeOstreptavi叫眦?ated {c.5’biotinylatedaptamermagneuc13eacl.pthrombin,、叶57biotinylated、sff。epta.vidin-alkaIine secondaryaptamerpnospnatasecoruugate图4基于磁性微球的电化学传感器。|”Fig.4Schemeof electrochemical sandwichassay coupledtOmagneticbeads[39]传感器的实用性。但三明治结构的凝血酶电化学适配体传感器不能实现整体意义上的再生,操作比较复杂。 三明治结构的电化学适配体传感器除了用于凝血酶的检测外,还成功用于可卡因的检测。Zhang等[41]把可卡因适配体分为两段,分别命名为CoS和CoB。CoS通过巯基固载在金电极上,末端修饰了生物素的CoB与可卡因和CoS形成夹心结构,而末端修饰了链菌素的辣根过氧物酶借助于链菌素与生物素之间的结合也固载在了金电极上。辣根过氧物酶可以氧化双氧水产生电信号,从而实现了对可卡因的检测。上面介绍的两类传感器都使用了标记的方法,即把探针分子直接或间接修饰在了核酸适配体的末端。非标记的电化学适配体传感器也有报道。比如利用亚甲基蓝能够结合鸟嘌呤碱基的特性,亚甲基蓝也被应用在了非标记的电化学适配体传感器中。例如Kim研究小组设计的传感器就基于此原理[42|。固载在电极上的核酸适配体未结合凝血酶时与亚甲基蓝结合,此时有明显的还原峰,而凝血酶的加入使亚甲基蓝从适配体上释放下来,导致还万方数据·238· 化工学报 第64卷原峰的下降。此传感器的检测限为11nmol·L~。Zhang等[43]设计了一款非常巧妙的非标记电化学传感器。文中使用的核酸适配体包含两段序列,序列一的靶目标为IFN一7,序列二可以和血晶素发生特异性结合,血晶素可以催化双氧水产生电信号。 然而当溶液中不存在IFN一7时,固载在金电极上的核酸适配体会发生自组装,这时适配体无法结合血晶素,因此没有电信号。当溶液中存在IFN一丫时,适配体的链会展开,暴露出序列二与血晶素结合,从而产生电信号,该电信号的强度与加入IFN一7的量存在对应关系,因此该传感器可用来检测体系中IFN一7的含量(图5)。㈨《斋cs鞭羔:s0:,嗥Auelec删。。。mi。I.-08 —04 一O一06 一O.2E(vsSCEgV图5用于检测IFN一7的非标记电化学传感器H副Fig.5Label—free electrochemical sensorforIFN—Y detection[伽此外基于电化学交流阻抗谱(EIS)的非标记核酸适配体电化学传感器也有报道。EIS是一种发展快速的电化学技术。主要用于研究物质表面的电化学性质,任何可以影响到电化学体系表面性质的过程都可以用EIS方法进行表征。比如,Rodrigu—ez等[44J将溶菌酶适配体固载在IT0电极上,适配体的负电荷界面会排斥阴离子氧化还原探针[Fe(CN)。]3叫4-,导致电子转移电阻的增加。当溶菌酶结合在电极上后,通过调节pH(大约在7附近),可以使电极的表面转化为带正电,带正电的电极对Fe(CN)S6叫4-产生吸引,进而减小电子转移电阻,使电信号增加,这就可以定量分析溶菌酶的含量(图6)。 同样的构思体现在Radi等H朝的工作上。不同之处在于,他们是通过电阻的增加实现对凝血酶的检测。原因在于,凝血酶不同于溶菌酶,在pH等于7附近,凝血酶近乎中性,对[Fe(CN)。]3叫4一不会产生电吸引,相反其庞大的体积和较高的疏水性会进一步阻碍[Fe(CN)。]3叫卜的电子传导,使电信号降低实现对凝血酶的检测。Lin等‘461和Su等m1也利用适配体结合靶目标后电阻增大的原理分别实现了对17t3一雌二醇和内毒素的检测。除[-Fe(CN)。]3叫4-外,[Ru(NH。)。]3+也被应用到非标记的核酸适配体电化学传感器中[481。上官莉等H们将末端巯基修饰的可卡因适配体作为捕获探针通过自组装的方法固定在金电极表面,构建适配体传感器。该传感器与目标分子可卡因和部分互补的检测适配体作用后,在电极表面形成适配体/可卡因/适配体复合物。以[Ru(NH。)。]3+为信号分子,基于单链适配体和适配体/可卡因/适配体复合物对[Ru(NH。)。]3+吸附量的不同,通过检测电极表面吸附[Ru(NH。)。]3+的还原电量,进行可卡因的分析检测。[Fe(CN!√ 喇洲譬/4-\b卿iotimerrylate—d霎重二泰:箩)8‘”pt。avid… ;1蕊iF—i/~.是,O-}Ffo毒善呈 。bindin盆^≥亍手≯,{.S≥ofproteinsataptamer-functionalizedITOelectrode[44]3.2光学传感器光学传感器和电化学传感器的设计理念类似,即把适配体一靶目标的特异性结合转化为可测量的信号,电化学传感器是转化为电信号,而光学传感器是转化为光信号。光学传感器可分为荧光传感器和比色传感器。 荧光传感器的设计思路有两种,一种为把适配体固载在微球上,待固载的适配体与靶目标结合后,在某种作用力下,荧光探针也吸附在微球,对吸附了荧光探针的微球进行荧光检测,进而得知待测物的浓度。比如Wang等[5叩利用凝血酶和溶血酶同时有两个核酸适配体作用位点的特性,把二者核酸适配体末端修饰不同的荧光探针,构建三明治结构的光学传感器,实现了凝血酶和溶血酶的同时检测。Liu等口1]把溶菌酶核酸适配体固载在纳米微球上,由于溶菌酶的等电点在11左右,因此在pH值为8.5的缓冲液中结合了溶菌酶的微球带正电,通过静电作用力,带负电的荧光探针也结合在微球上,进而实现对溶菌酶的检测(图7)。Li万方数据第1期李晓佩等:核酸适配体在生化分离及检测领域中的研究进展 .239.N烹P 00兰n饕产瓤m o——簟甄。产生、瓢(1 )eJ。。到。、节∥少窭鬣菩鬻瓷 擎趣告≯埯图7溶菌酶核酸适配体传感器[5uFig.7Schematicillustration oflysozymedetectionwithaptamer-immobilizedsilica NPandCPE[51]等[5铂根据DNA/Ag纳米簇靠近富含鸟嘌呤的DNA序列时其红色荧光会增强500倍的原理,设计了一款光学传感器。该课题组把Ag纳米簇修饰在含有15个碱基的凝血酶适配体上,富含鸟嘌呤的DNA序列修饰在含有29个碱基的凝血酶适配体上。 当溶液中存在凝血酶时,由于15碱基凝血酶适配体一凝血酶一29碱基凝血酶适配体三明治结构的形成,使得Ag纳米簇和富含鸟嘌呤的DNA序列靠近,得到增强的荧光信号。另外一种荧光传感器不需要对适配体进行固载,利用适配体与靶目标结合前后探针荧光光强会发生改变这一性质即可实现对待测物浓度的检测。Jiang等呻3基于适配体一靶目标复合形成前后,钌复合物的发光会发生改变的特性设计了一款光学传感器。原理为当不存在靶目标时,钌复合物嵌入核酸中,而靶目标的加入会诱导适配体的构象发生改变,从而影响了钌复合物的嵌入,最终导致发光改变。Choi等阳3把量子点修饰在凝血酶适配体的末端,当凝血酶和适配体结合后,凝血酶功能基团上的电子转移到了量子点上,而使量子点光致发光淬灭,实现对凝血酶含量的检测。Tan等[55]设计的荧光传感器原理如下:当溶液中不存在靶目标(ATP或凝血酶)时,单链的适配体会自组装,使局部呈双链状态,这时适配体会与一种染料小分子SG结合。自由的SG的荧光很弱,但是和适配体结合后会产生非常强的绿色荧光。当在溶液中加入靶目标后,SG与适配体分离,绿色荧光消失,从而实现对靶目标的检测。Nutiu等口61利用三条DNA链设计了一款光学传感器。 第二条和第三条DNA链同为第一条DNA链互补链的一部分。荧光基团和荧光淬灭基团分别修饰在第二条和第三条DNA链的末端,当靶目标不存在时,核酸杂交使得荧光基团和荧光淬灭基团互相靠近导致荧光淬灭,靶目标的加入破坏杂交结构,由此可以观察到荧光增强(图8),从而实现对ATP和凝血酶的检测。Chen等[573设计传感器的思路与Nutiu等类似,但他们是把荧光基团修饰在核酸适配体的末端,荧光淬灭基团修饰在其互补链的末端。当靶目标不存在时,核酸杂交导致荧光淬灭。靶目标的加入破坏杂交结构,由此可以观察到荧光增强,从而实现对赭曲霉素A的检测。“等[58]直接把荧光基团与淬灭基团标记在适配体两端,当靶分子与适配体结合后,适配体产生的三级结构使两端相互靠近,即可以产生淬灭的荧光信号,利用该方法,他们成功地实现了对凝血酶的检测。图8基于荧光淬灭一增强转换的适配体传感器[5阳Fig.8Designofstructure-switching signaling aptamers[56]比色传感器的设计比较简单,不需要对适配体进行固载,其中最常用的比色探针为金纳米粒子,原因为金纳米的分散度容易受到环境的影响,进而产生颜色的转变。Zheng等[5们基于比色方法,利用纳米金和RNA核酸适配体对多巴胺进行检测,检测原理为:纳米金会在高浓度的氯化钠溶液中发生聚集,当溶液中存在单链的核酸适配体时,适配体会吸附在纳米金表面阻止纳米金的聚集。然而当溶液中存在适配体的靶目标时,适配体会从纳米金的表面脱落下来与靶目标结合,而纳米金对适配体一靶目标复合物没有结合力。这时纳米金发生聚集,颜色由红色变为蓝色,从而实现对多巴胺浓度的检测(图9)。Song等[60]同样利用比色方法实现了对药物卡那徽素的检测。 3.3声学传感器声学传感器是检测识别元素和靶目标相互作用的一种非常实用的非标记方法。在声学传感器中,横向剪切模式(TSM)和石英晶体微天平(QCM)是两种比较常用的声学方法。基本原理为:石英晶体受高压电流的影响会沿表面平行方向振荡,晶体表面的变化,比如固载在晶体表面的适配体和靶目I《麓叭 臀万方数据.240. 化工学报 第64卷一少谚一Sp才朱,痧一,誊 桫 -【.pi、)AuNPs p,N【)BA 侈蛰dopainine嘞compoundofdolmmineandDBAlgEconcentration几g‘L只要寡核苷酸的随机序列库的库容量足够大,可以筛选出任何靶目标对应的核酸适配体。但由于适配体具有高负电荷密度的特性,当靶分子带有负电荷或疏水性比较强时,适配体的筛选就比较困难。同时目前投入使用的适配体数量并不多,众多针对于检测、分离领域的实验构思和验证也只限于数种适配体,在这两个领域中凝血酶核酸适配体的使用率最高,那么这些设计方案对于其他的适配体是否适用,还待于进一步的实验验证。 本文主要就核酸适配体在检测和生化分离领域的应用进行了概述。从文献调研情况来看,尽管近年来适配体在传感器方向的研究取得了瞩目的成果,但在实际应用中,还需进一步优化传感器的性能。并且多数研究只是针对于一种目标物的检测,针对于多种分析物的同时检测是未来适配体传感器发展的一大挑战。有关适配体在生化分离领域中应用的研究还比较少,其中怎样高效、温和地实现适配体一蛋白质复合物的解离是推动该方向发展的关键。总之,适配体在分离检测领域中的应用还待于进一步的研究深化。

◎欢迎参与讨论,请在这里发表您的看法、交流您的观点。

论文查重:

论文检测,论文查重第一家,是一家以检测抄袭与剽窃、伪造、篡改、不当署名、一稿多投等学术不端文献的论文检测平台,目前主要推荐的知名、权威检测产品包括中国知网的AMLC系统、VIP、TMLC2系统,万方数据库的万方相似比检测系统,维普文检测系统、gaperpass检测系统,等等常见检测软件

推荐软件知网期刊检测AMLC 知网本科检测 知网硕博检测 万方论文相似比检测 维普论文检测

检测须知:

1.此系统一旦提交,开始检测后,概不退款!2.在淘宝中购买宝贝后,可以在“我已购买宝贝”中看到有“订单编号”,知网系统检测需要输入订单编号才能使用。3.Word文档大小请不要超过15MB ,否则将无法上传;请把不必要的图片删除即可(系统不检测图片);4.上传检测的文档格式为Word的docx,doc格式,请勿上传其他格式的文档。

检测入口返回顶部
知网期刊检测
知网本科检测
知网硕博检测
万方论文检测
维普论文检测
paperpass
返回顶部